Gut膳食胆固醇通过调节肠道微生物群 [复制链接]

汇报人：研究生二年级王曼莉

本文于年7月发表于GUT杂志，影响因子19.，由香港中文大学医学院消化道肿瘤实验中心主任于君教授担任通讯作者，XiangZhang,OlabisiOluwabukolaCoker为共同一作。

研究背景

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是代谢综合征的肝脏表现，包括从肝脏单纯性脂肪变性到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)等多种肝脏疾病。NASH可发展为肝硬化、终末期肝衰竭和肝细胞性肝癌。目前，非酒精性脂肪肝是全世界发病率和医疗负担的主要原因。

在肝脏脂质物种中，胆固醇被认为是NASH发生的主要脂*性分子。膳食胆固醇对血浆和肝脏胆固醇稳态有重要影响。虽然饮食胆固醇对NASH进展的作用已有报道，但长期胆固醇治疗对自发性和进展性NAFLD-HCC发展的作用和致病基础尚不清楚。

肠道微生物与宿主有共生关系，通过代谢大肠中包括胆固醇在内的饮食成分来提供营养和能量。多项研究表明，肠道微生物是非酒精性脂肪性肝病发生发展的环境因素，其微生物代谢产物如胆汁酸、短链脂肪酸和三甲胺及其影响的信号通路可能与非酒精性脂肪性肝病的发生发展有关。

然而，肠道微生物群失调是否是膳食胆固醇诱导的NASH和NAFLD-HCC进展的原因或影响尚不清楚。

实验结果

01

膳食胆固醇可自发促进NAFLD-HCC的发生

为了研究膳食胆固醇在肝细胞脂肪变、非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化以及随后的NAFLD-HCC进化中的作用，用高脂高胆固醇饮食（HFHC）、高脂低胆固醇饮食（HFLC）以及正常饮食（NC）喂养小鼠。在不同时间点(3、8、10、12、14个月)监测血清AFP水平。与HFLC和NC喂养的小鼠相比，以HFHC喂养的小鼠，血清AFP水平在第10个月开始升高，在第12个月和第14个月升得更高。在第14个月，MRI扫描出了HFHC喂养小鼠的肝脏肿瘤，但在HFLC和NC小鼠中，则未扫描出肿瘤。肝切片组织学检查证实所有肝肿瘤均为肝细胞癌。

这些结果表明膳食胆固醇可以自发诱导NAFLD-HCC的形成。

伴随着肝癌的形成，在第14个月时，相比NC小鼠，喂食HFHC的小鼠体重、内脏脂肪、肝脏重量和肝脏体重比例明显增加。HFLC喂养的小鼠体重、内脏脂肪和肝脏重量也显著增加。

02

在喂食高胆固醇饮食14个月的小鼠中存在NASH和纤维化

进一步的肝脏切片检查发现，在喂食HFHC14个月的小鼠肝细胞癌旁组织和非肝细胞癌肝组织中存在脂肪性肝炎，其特征是脂肪变性和小叶炎,而在HFLC喂养的小鼠中只观察到脂肪变性。

用细胞因子分析法和ELISA法检测了HFHC喂养的小鼠血清和肝脏的促炎症因子，包括IL-6、IL-1α和IL-1β，发现上述因子有所升高。RNA测序分析表明，与HFLC喂养小鼠相比，HFHC喂养了14个月的小鼠肝组织中，与NASH息息相关的促炎细胞因子，包括Cx3cl1、Mcp1、Cxcl10、mip1β、mip1α、Ccl5、Cxcl16和TNF-α，都显著增高。

HFHC喂养的小鼠出现严重的肝脏纤维化损伤，胶原分布区明显增多。肝脏氧化应激的检测显示，在HFHC喂养小鼠中，氧化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)toNADH(NAD的降低形式)比值和抗氧化超氧化物歧化酶(SOD)活性显著降低，提示膳食胆固醇诱导了肝脏氧化应激。

总的来说，这些结果表明NASH和纤维化是在HFHC小鼠的非肝癌肝组织中形成的。

03

高胆固醇饮食引起小鼠脂肪肝、脂肪性肝炎和纤维化

为了阐明饮食胆固醇诱导肝癌形成前NAFLD的进展，课题组监测了喂食HFHC小鼠的血清ALT、AST、胆固醇、AFP和肝脏组织学变化。分别于喂食后3、8、10和12个月处死小鼠。实验结果显示，与喂食HFLC的小鼠相比，在3个月和8个月时，喂食HFHC的小鼠体重和内脏脂肪重量增加，同时肝脏重量和肝体重比也增加。血清ALT和AST的增加与HFHC小鼠血清胆固醇水平的增加是一致的。

HFHC喂养的小鼠肝脏组织学显示，3个月时出现脂肪变性，轻度炎症，8个月时出现肝纤维化，10、12和14个月时出现肝癌形成，而hflc喂养的小鼠在3、8、10和14个月时只出现脂肪变性，而肝癌没有进一步发展。

上述结果表明，HFHC小鼠逐渐发展为脂肪变性、脂肪肝、肝纤维化和肝细胞癌。

04

膳食胆固醇诱导的肠道微生物群失调在NAFLD-HCC发生发展中的作用

为了探讨肠道微生物群在介导膳食胆固醇诱导的NAFLD-HCC中的潜在作用，课题组对HFLC-fed和HFHC-fed小鼠的粪便进行了16SrRNA基因测序。

采用主成分分析(PCA)方法，观察了HFLC-fed和HFHC-fed小鼠14个月时肠道微生物群的组成鉴别(p0.)。此外，与HFLC饲料喂养的仅有单纯脂肪变性的小鼠相比，在14个月时，HFHC喂养的HCC小鼠的细菌多样性降低，细菌丰富度（richness）升高。

主成分分析和冗余度分析也表明，HFHC喂养3个月(单纯性脂肪变性伴轻度炎症)、8个月(脂肪性肝炎伴纤维化)和14个月(HCC)小鼠肠道微生物组成明显聚集(cluster），提示NAFLD-HCC进展过程中肠道微生物组成的变化。

此外，随着NAFLD-HCC进展，细菌丰富度（richness）也相应增加。

在HFHC饲养期间，从3个月到8个月、14个月分别观察到Mucispirillumschaedleri_otu、Desulfovibrio_Otu、Anaerotruncus_Otu和Desulfovibrionaceae_Otu的逐渐增加。

此外，课题组在高胆固醇饮食组中还观察到了ClostridiumOTUs的富集，Clostridiumcelatum_Otu,C.ruminantium_Otu,C.cocelatum_Otu和C.methylpentosum_Otu，以及Bifidobacterium_Otu,Akkermansiamuniciphila_Otu,Lactobacillus_Otu,Bacteroidesacidifaciens_Otu,Bacteroides_Otu,B.uniformis_OtuandB.eggerthii_Otu的消耗。

与HFLC喂养的小鼠相比，HFHC小鼠肠道微生物群相关色氨酸tryptophan代谢能力降低(图4E)。综上所述，这表明高胆固醇饮食导致了肠道微生物群的失调以及微生物色氨酸代谢的受损。

在HFHC-fed小鼠粪便样品中富集的M.schaedleri_Otu,Desulfovibrio_Otu,Anaerotruncus_Otu,Ccelatum_Otu,C.cocelatum_Otu和C.methylpentosum_Otu与高胆固醇饮食、血清胆固醇水平、肝脏胆固醇水平呈正相关，而HFHC饲养小鼠粪便中缺乏的Bifidobacterium_Otu,B.acidifaciens_Otu,B.uniformis_Otu,A.municiphila_Otu，Lactobacillus_Otu与高胆固醇饮食、血清和肝脏胆固醇水平呈负相关。

为了在人类患者中证实动物实验结果，课题组分析了59例NAFLD-HCC患者和39例健康受试者的血清胆固醇和肠道微生物群的相关性。双歧杆菌和拟杆菌BifidobacteriumandBacteroides与血清总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇呈负相关，与高密度脂蛋白胆固醇呈正相关。这些结果与HFHC小鼠的观察结果一致，进一步推断肠道微生物群参与了胆固醇诱导的紊乱。

05

膳食胆固醇通过诱导代谢物改变促进NASH-HCC进程

根据膳食胆固醇含量不同，血清代谢物有显著差异。

胆汁酸合成是高胆固醇饮食小鼠体内改变的关键通路。

牛磺胆酸TCA(taurocholicacidTCA)、牛磺熊脱氧胆酸(taursodeoxycholicacid，TUDCA)、甘油胆酸GCA(glycocholicacidGCA)和牛磺鹅脱氧胆酸(taurochenodeoxycholicacid，TCDCA)是HFHC喂养小鼠中异常上调的代谢产物。另一方面，3-吲哚丙酸(IPA)是微生物色氨酸代谢的产物，是hfhc喂养的小鼠的异常下调代谢产物。

与HFLC-fed小鼠相比，HFHC-fed小鼠门静脉血清脂多糖(LPS)浓度升高，结肠上皮钙粘附素(E-cadherin)丢失，提示膳食胆固醇可能损害肠道屏障功能。

体外实验表明，TCA加重了人正常永生化肝细胞系LO2中胆固醇诱导的甘油三酯积累，IPA抑制了NASH-HCC细胞系HKCI-2和HKCI-10中胆固醇诱导的脂质积累和细胞增殖。这些结果表明，胆固醇通过调节宿主血清代谢物，至少部分通过增加TCA和降低IPA，促进NASH-HCC的进展。

06

高胆固醇调节肠道微生物促进无菌小鼠脂肪性肝炎和肝细胞增殖

课题组通过粪菌移植(FMT)评价胆固醇调控的微生物群在NAFLD-HCC中的作用。分别将NC-fed、HFLC-fed和HFHC-fed14个月的小鼠的粪便灌胃至用NC饲料喂养的无菌小鼠(下面用G-NC，G-HFLC和G-HFHC分别代指)。

与G-NC小鼠相比，G-HFHC小鼠肝体重比显著升高。另外，在FMT后8、10和14个月，G-HFHC小鼠肝脏脂质的累积显著增加，过氧化反应的显著增加，并伴有肝组织学损害。

与G-HFLC小鼠相比，G-HFHC小鼠包括IL-6在内的肝细胞因子和趋化因子升高，cDNA表达测定表明Fos,Ccl12,Cxcr1,Ccl1,Myd88,Il-1β,Cxcl10andC3ar1升高，这都证实了炎症反应的增加。

G-HFHC小鼠肝细胞增殖在粪菌移植后14个月时明显增加(p0.05)，在14个月时可观察到一个肝结节。

无菌小鼠血清代谢产物分析显示，与G-HFLC小鼠相比，G-HFHC小鼠的IPA降低，与常规饲喂HFHC的小鼠相一致。

综上所述，这些数据表明膳食胆固醇调控的微生物群通过诱导代谢物改变促进NAFLD和肝细胞增殖，从而促进胆固醇诱导的NAFLD-HCC的形成。

07

抗胆固醇治疗完全阻止了hfhc喂养小鼠NAFLD-HCC的形成

抗胆固醇阿托伐他汀治疗可显著恢复hfhc-fed小鼠体内增加的细菌数量。

此外，在HFHC喂养的小鼠OTUs失调中，抗胆固醇治疗可逆转毛霉菌Mucispirillumschaedleri_otu、脱硫弧菌sulfovibrio_otu、厌氧共同截尾菌anaerotrunus_otu和脱硫弧菌科saldifovibrionaceae_otu的丰度。

讨论和总结

尽管众所周知胆固醇在NASH中是一种细胞*性脂质，但是胆固醇在NASH发展到HCC过程中的作用和机制仍不明确。在这项研究中，课题组首次证明了长期高胆固醇饮食导致小鼠自发性NAFLD-HCC的发展。高脂肪饮食会导致肥胖、胰岛素抵抗、糖耐量下降和脂肪变性。然而，脂肪性肝炎向纤维化和肝癌的进展主要与高膳食胆固醇有关。

越来越多的证据表明，人类肠道微生物群可以影响各种病理状态，包括肝癌。因此，课题组探讨了肠道微生物群在介导膳食胆固醇诱导的NAFLD-HCC中的潜在作用。结果表明抑制保护性肠道微生物可能是胆固醇在肝脏中发挥其致癌作用的一种手段。课题组的研究结果为胆固醇诱导的NAFLD-HCC进展中肠道失调的潜在作用提供了新的见解。

除了肠道微生物群失调外，共生菌产生的小分子代谢产物也可能参与NAFLD的发病。肠道微生物相关代谢物，包括短链脂肪酸、氨基酸分解代谢物和胆汁酸，能激动和拮抗它们的同源受体，减少或加重肝脏脂肪变性和炎症。代谢组学分析表明，高胆固醇饮食使胆汁酸代谢受损。在HFHC喂养的小鼠体内富集了原发性胆汁酸，包括TCA、GCA、TCDCA和TUDCA，与之前报道的人类NASH患者高血浆TCA、GCA和TCDCA相一致。

此外，专门由共生肠道微生物产生的IPA，在用HFHC喂养的常规小鼠和移植了HFHC小鼠粪便的无菌小鼠中都被消耗了。

这些研究结果表明，胆固醇可以损害胆汁酸代谢和微生物色氨酸代谢，导致血清TCA的升高，IPA的降低，从而促进NAFLD-HCC的发展。

综上所述，本研究首次表明，长期高膳食胆固醇通过调节肠道微生物群，促进NAFLD-HCC在雄性小鼠中的自发和进展性发展。胆固醇通过改变肠道微生物群诱导TCA升高和IPA降低，从而促进脂质积累和肝细胞增殖，导致NAFLD-HCC的发生。抗胆固醇治疗完全消除膳食胆固醇诱导的NAFLD-HCC的形成。本研究强调胆固醇抑制和调控肠道微生物群及其相关代谢产物可能是预防NAFLD-HCC的有效策略。

指导老师：孙志广

稿件编辑：王曼莉

稿件审阅：孙志广